240 мкмоль/мин

0,002 мкмоль

Молярная активность указывает, сколько молекул субстрата превращается од­ ной молекулой фермента за I минуту (молярную активность иногда обозначают как «число оборотов»), В табл. 2.5 приведена молярная активность некоторых ферментов.

Таблица 2.5. Молярная активность некоторых ферментов

	Л кги вн осгь.
Карбоангидраза С		(3-Галактозидаза
Л5-3-кетостероидизомераза		Фосфоглюкомутаза
Супероксиддисмутаза		Cyкцинатдегидрогеназа
Каталаза		Бифункциональный
(3-Амилаза
Фумараза

Так называемый бифункциональный фермент имеет наиболее низкую моляр­ ную активность среди известных. Однако это не означает, что его физиологичес­ кая роль тоже низка (подробнее об этом ферменте см. рис. 9.31).

Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры, pH и времени инкубации

Зависимость скорости реакции от температуры. Скорость ферментативных ре­ акций, как и всяких других, зависит от температуры: при повышении температу­ ры на каждые 10 0C скорость увеличивается примерно вдвое (правило Вант-Гоф­ фа). Однако для ферментативных реакций это правило справедливо лишь в обла­ сти низких температур - до 50-60 °С. При более высоких температурах ускоряется денатурация фермента, что означает уменьшение его количества; со­ ответственно снижается и скорость реакции (рис. 2.17, г). При 80-90 0C большин­ ство ферментов денатурируется практически мгновенно. Количественное опреде­ ление ферментов рекомендуется проводить при 25 °С.

Зависимость скорости реакции от pH. Изменение pH приводит к измене­ нию степени ионизации ионогенных групп в активном центре, а это влияет на сродство субстрата к активному центру и на каталитический механизм. Кроме того, изменение ионизации белка (не только в области активного центра) вызы­ вает конформационные изменения молекулы фермента. Колоколообразная фор­ ма кривой (рис. 2.17, д) означает, что существует некоторое оптимальное состоя­ ние ионизации фермента, обеспечивающее наилучшее соединение с субстратом и катализ реакции. Оптимум pH для большинства ферментов лежит в пределах от 6 до 8. Однако есть и исключения: например, пепсин наиболее активен при pH 2. Количественное определение ферментов проводят при оптимальном для данно­ го фермента pH.

Зависимость скорости реакции от времени. По мере увеличения времени инкубации скорость реакции снижается (рис. 2.17, е). Это может происходить

вследствие уменьшения концентрации субстрата, увеличения скорости обратной реакции (в результате накопления продукта прямой реакции), ингибирования фермента продуктом реакции, денатурации фермента. При количественном оп­ ределении ферментов и кинетических исследованиях измеряют начальную ско­ рость реакции (скорость непосредственно после начала реакции). Время, в тече­ ние которого скорость с допустимым приближением можно считать начальной, для каждого фермента и для данных условий подбирается экспериментально, на основе графика, представленного на рис. 2.17, е. прямолинейный участок графи­ ка, начинающийся от отметки нулевого времени, соответствует интервалу време­ ни, в течение которого скорость реакции равна начальной скорости или близка к ней (на рисунке этот интервал отмечен пунктирной линией).

ИНГИБИТОРЫ ФЕРМЕНТОВ

Ингибиторами ферментов называют вещества, снижающие их активность. Наи­ больший интерес представляют ингибиторы, взаимодействующие с активным центром фермента. Такие ингибиторы чаще всего являются структурными анало­ гами субстрата и, следовательно, комплементарны активному центру фермента. Поэтому они подавляют активность только одного фермента или группы фермен­ тов с очень сходным устройством активного центра. Различают ингибиторы кон­ курентные и неконкурентные, обратимые и необратимые.

Малоновая кислота HOO C -CH2-COOH является структурным аналогом ян­ тарной кислоты, поэтому она может присоединяться к активному центру сукцинатдегидрогеназы (см. выше). Ho дегидрирование малоновой кислоты невозмож­ но. Если в реакционной смеси имеются одновременно и янтарная, и малоновая кислоты, то происходят следующие процессы:

E + S J ± E S « 2 E + P

Некоторые молекулы фермента оказываются занятыми ингибитором (I) и не участвуют в реакции превращения субстрата: следовательно, скорость образования продукта снижается. Если повышать концентрацию субстрата, то доля комплекса ES увеличивается, а комплекса EI уменьшается: субстрат и ингибитор конкурируют за активный центр фермента. Это пример конкурентного ингибирования. При до­ статочно высокой концентрации субстрата весь фермент будет в форме комплекса ES и скорость реакции будет максимальной, несмотря на присутствие ингибитора.

Некоторые ингибиторы образуют комплекс не со свободным ферментом, а с фермент-субстратным комплексом:

В этом случае повышение концентрации субстрата не уменьшает действие ин­ гибитора; такие ингибиторы называются неконкурентными.

В некоторых случаях ингибитор может подвергаться химическому превраще­ нию под действием фермента. Например, n-нитрофенилацетат гидролизуется протеолитическим ферментом химотрипсином; гидролиз происходит в две ста­ дии (рис. 2.18).

a O2 N-
E- О- С- CH, + Н,О - E- ОН+HO- С- CH3 +H0O

Рис. 2.18. Гидролиз л-нитрофенилацетата химотрипсином

Сначала ацетильный остаток присоединяется к гидроксильной группе остатка серина в активном центре фермента (реакция а), а затем происходит гидролиз ацетил-фермента (реакция б). Первая стадия протекает быстро, а вторая - очень медленно, поэтому даже при небольших концентрациях и-нитрофенилацетата значительная часть молекул фермента находится в ацетилированной форме, и скорость гидролиза природного субстрата (пептидов) снижается. Такие ингиби­ торы называют псевдосубстратами или плохими субстратами.

Иногда химическое превращение ингибитора в активном центре приводит к образованию промежуточного продукта, очень прочно, необратимо связанного с ферментом: такое явление называют суицидным катализом. Например, 3-хлора- цетолфосфат необратимо ингибирует триозофосфатизомеразу. Этот ингибитор является структурным аналогом диоксиацетонфосфата: он дехлорируется и нео­ братимо присоединяется к остатку глутаминовой кислоты в активном центре фер­

	мента (рис. 2.19).
				CH2 - O P O 3 H2

	C Th 2

Рис. 2.19. Необратимое ингибирование триозофосфатизомеразы

Ингибиторами могут быть не только аналоги субстратов, но и аналоги коферментов, способные занимать место настоящего кофермента, но не способные выполнять его функцию.

Взаимодействие фермента с ингибитором часто в такой же мере специфич­ но, как и взаимодействие с субстратом или коферментом. На этом основано

применение ингибиторов для избирательного подавления активности того или иного фермента в сложной ферментной системе или в организме. В частности, многие лекарственные вещества являются ингибиторами определенных ф ер­ ментов.

Есть ингибиторы, действующие менее избирательно. Например, и-хлормерку- рибензоат является специфическим реагентом на сульфгидрильные группы в бел­ ках (рис. 2.20). Поэтому и-хлормеркурибензоат ингибирует все ферменты, кото­ рые имеют SH-группы, участвующие в катализе.

Cys- SH+ Cl- Hg-

COOH ™ Cys- S- Hg- (^ j >- COOH

Рис. 2.20. Реакция л-хлормеркурибензоата с сульфгидрильными группами белков

Другим примером может служить ингибирование диизопропилфторфосфатом пептидгидролаз и эстераз, имеющих серин в активном центре. Ингибитор необра­ тимо присоединяется к остатку серина (рис. 2.21).

H3C - C H - C H 3

Рис. 2.21. Ингибирование диизопропилфторфосфатом сериновых ферментов

Остатки серина вне активного центра при этом остаются незатронутыми; сле­ довательно, фермент сам катализирует реакцию, которая губит его. Диизопропилфторфосфат - представитель группы фосфорорганических соединений, об­ ладающих чрезвычайно высокой токсичностью. Токсическое действие обусловле­ но именно ингибированием ферментов, и прежде всего ацетилхолинэстеразы (см. гл. 22).

Пенициллин, одно из самых известных и распространенных лекарств, приме­ няется для лечения ряда инфекционных заболеваний. Пенициллин необратимо ингибирует фермент бактерий гликопептид-трансферазу. Этот фермент участву­ ет в синтезе бактериальной стенки, и поэтому в присутствии пенициллина размно­ жение бактерий невозможно. Гликопептид-трансфераза содержит остаток сери­ на в активном центре (сериновая пептидгидролаза). В молекуле пенициллина есть амидная связь, по свойствам сходная с пептидной связью (рис. 2.22). В результате разрыва этой связи, катализируемого ферментом, остаток пенициллина оказыва­ ется необратимо связанным с ферментом.

Ингибиторы - очень эффективные инструменты для исследования строения активного центра ферментов и механизма катализа. Ингибиторы, необратимо

Государственная система обеспечения
единства измерений

СТАНДАРТ-ТИТРЫ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ
БУФЕРНЫХ РАСТВОРОВ -
РАБОЧИХ ЭТАЛОНОВ рН 2- го и 3- го РАЗРЯДОВ

Технические и метрологические характеристики

Методы их определения

Москва Стандартинформ 200 8

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-97 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Порядок разработки, принятия, применения, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным унитарным предприятием «Всероссийский научно-исследовательский институт физико-технических и радиотехнических измерений» (ФГУП «ВНИИФТРИ») Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол № 26 от 8 декабря 2004 г.)

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Азербайджан		Азстандарт
Беларусь		Госстандарт Республики Беларусь
Казахстан		Госстандарт Республики Казахстан
Кыргызстан		Кыргызстандарт
Молдова		Молдова-Стандарт
Российская Федерация		Федеральное агентство по техническому регулированию и метрологии
Таджикистан		Таджикстандарт
Узбекистан		Узстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 15 апреля 2005 г. № 84-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 8.135-2004 введен в действие непосредственно в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 августа 2005 г.

6 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Декабрь 2007 г.

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему публикуется в указателе «Национальные стандарты».

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в указателе (каталоге) «Национальные стандарты», а текст изменений - в информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована в информационном указателе «Национальные стандарты»

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

Дата введения - 2005-08-01

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на стандарт-титры, представляющие собой точные навески химических веществ во флаконах или ампулах, предназначенные для приготовления буферных растворов с определенными значениями рН, и устанавливает технические и метрологические характеристики и методы их определения.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

3.4 Стандарт-титры изготавливают с навесками химических веществ, необходимыми для приготовления 0,25; 0,50 и 1 дм 3 буферного раствора. Номинальная масса навески вещества, необходимая для приготовления 1 дм 3 буферного раствора, приведена в таблице .

Таблица 1

	Химические вещества, входящие в состав стандарт-титра	Номинальная масса навески вещества m ном входящего в состав стандарт-титра, для приготовления 1 дм 3 буферного раствора 1 , г	Номинальное значение рН буферного раствора при 25 °С 2)
	× 2Н 2 О	25,219	1,48
	Калий тетраоксалат 2-водный КН 3 (С 2 О 4) 2 × 2Н 2 О	12,610	1,65
	Натрий гидродигликолят C 4 H 5 O 5 Na	7,868	3,49
	Калий гидротартрат КНС 4 Н 4 С 6	9,5 3)	3,56
	Калий гидрофталат КНС 8 Н 4 О 4	10,120	4,01
	Кислота уксусная СН 3 СООН Натрий ацетат CH 3 COONa	6,010 8,000	4,64
	Кислота уксусная СН 3 СООН Натрий ацетат CH 3 COONa	0,600 0,820	4,71
	Пиперазинфосфат C 4 H 10 N 2 H 3 PO 4	4,027	6,26
	Натрий моногидрофосфат Na 2 HPO 4	3,3880 3,5330	6,86
	Калий дигидрофосфат КН 2 РО 4 Натрий моногидрофосфат Na 2 HPO 4	1,1790 4,3030	7,41
	Калий дигидрофосфат КН 2 РО 4 Натрий моногидрофосфат Na 2 HPO 4	1,3560 5,6564	7,43
	Трис 4) (HOCH 2 ) 3 CNH 2 Трис 4) гидрохлорид (НОСН 2) 3 CNH 2 HCl	2,019 7,350	7,65
	Натрий тетраборат 10-водный Na 2 B 4 O 7 × 10Н 2 О	3,8064	9,18
	Натрий тетраборат 10-водный Na 2 B 4 O 7 × 10Н 2 О	19,012	9,18
	Натрий углекислый Na 2 CO 3 Натрий углекислый кислый NaHCO 3	2,6428 2,0947	10,00
	Кальций гидрооксид Са(ОН) 2	1,75 3)	12,43
1) Для приготовления буферного раствора объемом 0,50 и 0,25 дм 3 массу навески вещества необходимо уменьшить соответственно в 2 и 4 раза. 2) Зависимость значений рН буферных растворов от температуры приведена в приложении . 3) Навеска для приготовления насыщенного раствора. 4) Трис-(оксиметил)-аминометан.

3.5 Массы навесок веществ в стандарт-титрах должны соответствовать номинальным значениям с допускаемым отклонением не более 0,2 %. Массы навесок веществ в стандарт-титрах для приготовления насыщенных растворов гидротартрата калия и гидрооксида кальция должны соответствовать номинальным значениям с допускаемым отклонением не более 1 %.

3.6 Буферные растворы, приготовленные из стандарт-титров, должны воспроизводить номинальные значения рН, приведенные в таблице .

Допускаемые отклонения от номинального значения рН не должны выходить за пределы:

± 0,01 рН - для буферных растворов - рабочих эталонов рН 2-го разряда;

± 0,03 рН - для буферных растворов - рабочих эталонов рН 3-го разряда.

3.7 Стандарт-титры допускается изготавливать в виде навесок порошков химических веществ и в виде их водных растворов (стандарт-титры с уксусной кислотой - только в виде водных растворов), расфасованных в герметически закрываемые флаконы или запаянных в стеклянные ампулы.

Для приготовления водных растворов используют дистиллированную воду по ГОСТ 6709 .

3.8 Требования к расфасовке, упаковке, маркировке и транспортированию стандарт-титров - по техническим условиям на конкретные стандарт-титры.

3.9 Эксплуатационная документация на стандарт-титры должна содержать следующую информацию:

Назначение: разряд (2-й или 3-й) рабочих эталонов рН - буферных растворов, приготавливаемых из стандарт-титров;

Номинальное значение рН буферных растворов при 25 °С;

Объем буферных растворов в кубических дециметрах;

Методику (инструкцию) приготовления буферных растворов из стандарт-титров, разработанную в соответствии с приложением настоящего стандарта;

Срок годности стандарт-титра.

4 Методы определения характеристик стандарт-титров

4.1 Количество образцов n для определения характеристик каждой модификации стандарт-титров отбирают по ГОСТ 3885 в зависимости от объема партии стандарт-титров данной модификации, но не менее трех образцов стандарт-титров в ампулах (для определения рН) и не менее шести образцов во флаконах (3 - для определения массы, 3 - для определения рН).

4.2 Используемые средства измерений должны иметь свидетельства о поверке (сертификаты) с действующим сроком поверки.

4.3 Измерения проводят в нормальных условиях:

температура окружающего воздуха, °С 20 ± 5;

относительная влажность воздуха, % от 30 до 80;

атмосферное давление, кПа (мм. рт. ст.) от 84 до 106 (от 630 до 795).

4.4 Массу навески химического вещества во флаконе 1) определяют по разнице массы флакона с навеской и массы пустого чистого флакона. Измерения массы навески и массы флакона проводят с погрешностью не более 0,0005 г на аналитических весах (класс точности не ниже 2 по ГОСТ 24104).

1) В стеклянной ампуле массу навески стандарт-титра не определяют.

4.4.1 Отклонение D i , %, массы навески от номинального значения массы для каждого из образцов определяют по формуле

где m ном - номинальная масса навески химического вещества, входящего в состав стандарт-титра (см. таблицу );

i

m i - результат измерения массы i -го образца (i = 1 ... n ), г.

4.4.2 Если хотя бы для одного из образцов значение D i будет более 0,2 % (а для стандарт-титров для приготовления насыщенных буферных растворов - более 1 %), то партию стандарт-титров данной модификации бракуют.

4.5.1 Значение рН буферного раствора - рабочего эталона рН 2-го разряда, приготовленного из стандарт-титра, определяют при помощи рабочего эталона рН 1-го разряда (ГОСТ 8.120) при температуре буферных растворов (25 ± 0,5) °С в соответствии с методиками выполнения измерений рН, входящими в нормативные документы рабочего эталона рН 1-го разряда.

4.5.1.1 Отклонение рН от номинального значения (D рН ) i , определяют по формуле

(D рН ) i = | рН ном - рН i | ,

где i - номер образца стандарт-титра;

рН ном - номинальное значение рН буферного раствора по таблице ;

рН i - результат измерения значения рН i -го образца (i = 1 ... n ).

4.5.1.2 Если значение (D рН ) i для каждого из буферных растворов не более 0,01 рН, то стандарт-титры данной партии считают пригодными для приготовления рабочего эталона рН 2-го разряда.

Если значение (D рН ) i для каждого из буферных растворов не более 0,03 рН, то стандарт-титры данной партии считают пригодными для приготовления рабочего эталона рН 3-го разряда.

(D рН ) i

4.5.4 Значение рН буферного раствора - рабочего эталона рН 3-го разряда, приготовленного из стандарт-титра, определяют эталонным рН-метром 2-го разряда (ГОСТ 8.120) в соответствии с руководством по эксплуатации рН-метра при температуре буферных растворов (25 ± 0,5) °С.

4.5.2.1 Отклонение рН от номинального значения (D рН ) i определяют по .

4.5.2.2 Если значение (D рН ) i для каждого из буферных растворов не более 0,03 рН, то стандарт-титры данной партии считают пригодными для приготовления рабочего эталона рН 3-го разряда.

Если хотя бы для одного из буферных растворов (D рН ) i будет более 0,03 рН, то измерения повторяют на удвоенном числе образцов.

Результаты повторных измерений являются окончательными. При отрицательных результатах партию стандарт-титров бракуют.

Приложение А
(обязательное)

Химические вещества для стандарт-титров получают путем дополнительной очистки химических реактивов квалификации не ниже ч.д.а. Химические реактивы квалификаций ос.ч и х.ч могут использоваться без дополнительной очистки. Однако конечным критерием их пригодности для стандарт-титров является значение рН буферных растворов, приготовленных из стандарт-титров. Для очистки веществ необходимо использовать дистиллированную воду (далее - вода) с удельной электропроводностью не более 5 × 10 -4 См × м -1 при температуре 20 °С по ГОСТ 6709 .

А.1 Калий тетраоксалат 2-водный КН 3 (С 2 О 4) 2 × 2Н 2 О очищают двойной перекристаллизацией из водных растворов при температуре 50 °С. Сушат в сушильном шкафу с естественной вентиляцией при температуре (55 ± 5) °С до постоянной массы.

А.2 Натрий гидродигликолят (оксидиацетат) C 4 H 5 O 5 Na высушивают при температуре 110 °С до постоянной массы. Если химического реактива не имеется в наличии, то натрий гидродигликолят получают половинной нейтрализацией соответствующей кислоты гидрооксидом натрия. После кристаллизации кристаллы отфильтровывают на пористом стеклянном фильтре.

А.3 Калий гидротартрат (калий виннокислый кислый) КНС 4 Н 4 О 6 очищают двойной перекристаллизацией из водных растворов; сушат в сушильном шкафу при температуре (110 ± 5) °С до постоянной массы.

А.4 Калий гидрофталат (калий фталевокислый кислый) КНС 8 Н 4 О 4 очищают двойной перекристаллизацией из горячих водных растворов с добавкой углекислого калия при первой перекристаллизации. Отфильтровывают выпавшие кристаллы при температуре не ниже 36 °С. Сушат в сушильном шкафу с естественной вентиляцией при температуре (110 ± 5) °С до постоянной массы.

А.5 Кислоту уксусную СН 3 СООН (ГОСТ 18270) очищают одним из следующих способов:

а) перегонкой с добавлением небольшого количества безводного ацетата натрия;

б) двойным дробным вымораживанием (после окончания процесса кристаллизации избыток жидкой фазы удаляется).

А.6 Натрий уксуснокислый 3-водный (натрий ацетат) CH 3 COONa × 3Н 2 О (ГОСТ 199) очищают двойной перекристаллизацией из горячих водных растворов с последующим прокаливанием соли при температуре (120 ± 3) °С до постоянной массы.

А.7 Пиперазинфосфат C 4 H 10 N 2 H 3 PO 4 × Н 2 О синтезируют из пиперазина и ортофосфорной кислоты (ГОСТ 6552), очищают тройной перекристаллизацией из спиртовых растворов. Сушат над силикагелем в темноте в эксикаторе до постоянной массы.

А.8 Калий фосфорнокислый однозамещенный (калий дигидрофосфат) КН 2 РО 4 (ГОСТ 4198) очищают двойной перекристаллизацией из водно-этанольной смеси с объемным соотношением 1: 1 и последующим высушиванием в сушильном шкафу при температуре (110 ± 5) °С до постоянной массы.

А.9 Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный (натрий моногидрофосфат) Na 2 HPO 4 (безводный) получают из 12-водной соли Na 2 HPO 4 × 12Н 2 О (ГОСТ 4172) трехкратной перекристаллизацией из горячих водных растворов. Сушат (обезвоживают) в сушильном шкафу с естественной вентиляцией поэтапно в следующих режимах:

При (30 ± 5) °С - до постоянной массы

При (50 ± 5) °С - » » »

При (120 ± 5)°С- » » »

А.10 Трис-(оксиметил)-аминометан (HOCH 2 ) 3 CNH 2 сушат при 80 °С в сушильном шкафу до постоянной массы.

А.11 Трис-(оксиметил)-аминометан гидрохлорид (HOCH 2 ) 3 CNH 2 HCl сушат при 40 °С в сушильном шкафу до постоянной массы.

А.12 Натрий тетраборат 10-водный Na 2 B 4 O 7 × 10Н 2 О (ГОСТ 4199) очищают трехкратной перекристаллизацией из водных растворов при температуре (50 ± 5) °С. Сушат при комнатной температуре в течение двух-трех дней. Окончательную подготовку тетрабората натрия проводят выдерживанием соли в стеклографитовой (кварцевой, платиновой или фторопластовой) чашке в эксикаторе над насыщенным раствором смеси хлорида натрия и сахарозы или насыщенным раствором KBr при комнатной температуре до постоянной массы.

А.13 Натрий углекислый Na 2 CO 3 (ГОСТ 83) очищают трехкратной перекристаллизацией из водных растворов с последующим высушиванием в сушильном шкафу при температуре (275 ± 5) °С до постоянной массы.

А.14 Натрий углекислый кислый NaHCO 3 (ГОСТ 4201) очищают трехкратной перекристаллизацией из водных растворов с барботированием углекислым газом.

А.15 Кальций гидрооксид Са(ОН) 2 получают кальцинированием углекислого кальция СаСО 3 (ГОСТ 4530) при температуре (1000 ± 10) °С в течение 1 ч. Образовавшуюся окись кальция СаО охлаждают на воздухе при комнатной температуре и медленно, небольшими порциями заливают водой при постоянном перемешивании до получения суспензии. Суспензию подогревают до кипения, охлаждают и фильтруют через стеклянный фильтр, затем снимают с фильтра, сушат в вакуум-эксикаторе до постоянной массы и измельчают до тонкого порошка. Хранят в эксикаторе.

Приложение Б
(справочное)

Номер модификации стандарт-титра	Химические вещества, входящие в состав стандарт-титра (модификации по таблице )	рН буферных растворов при температуре, °С
	Калий тетраоксалат 2-водный					1,48	1,48	1,48	1,49	1,49	1,50	1,51	1,52	1,53	1,53
	Калий тетраоксалат 2-водный			1,64	1,64	1,64	1,65	1,65	1,65	1,65	1,65	1,66	1,67	1,69	1,72
	Натрий гидродигликолят		3,47	3,47	3,48	3,48	3,49	3,50	3,52	3,53	3,56	3,60
	Калий гидротартрат						3,56	3,55	3,54	3,54	3,54	3,55	3,57	3,60	3,63
	Калий гидрофталат	4,00	4,00	4,00	4,00	4,00	4,01	4,01	4,02	4,03	4,05	4,08	4,12	4,16	4,21
		4,66	4,66	4,65	4,65	4,65	4,64	4,64	4,65	4,65	4,66	4,68	4,71	4,75	4,80
	Кислота уксусная + натрий ацетат	4,73	4,72	4,72	4,71	4,71	4,71	4,72	4,72	4,73	4,74	4,77	4,80	4,84	4,88
	Пиперазинфосфат		6,48	6,42	6,36	6,31	6,26	6,21	6,14	6,12	6,03	5,95
		6,96	6,94	6,91	6,89	6,87	6,86	6,84	6,83	6,82	6,81	6,82	6,83	6,85	6,90
	Натрий моногидрофосфат + калий дигидрофосфат	7,51	7,48	7,46	7,44	7,42	7,41	7,39	7,37
	Натрий моногидрофосфат + калий дигидрофосфат		7,51	7,49	7,47	7,45	7,43	7,41	7,40
	Трис гидрохлорид + трис	8,40	8,24	8,08	7,93	7,79	7,65	7,51	7,33	7,26	7,02	6,79
	Натрий тетраборат	9,48	9,41	9,35	9,29	9,23	9,18	9,13	9,07	9,05	8,98	8,93	8,90	8,88	8,84
	Натрий тетраборат	9,45	9,39	9,33	9,28	9,23	9,18	9,14	9,09	9,07	9,01	8,97	8,93	9,91	8,90
	Натрий углекислый кислый + натрий углекислый	10,27	10,21	10,15	10,10	10,05	10,00	9,95	9,89	9,87	9,80	9,75	9,73	9,73	9,75
	Кальций гидрооксид	13,36	13,16	12,97	12,78	12,60	Примечание - Для приготовления растворов со значением рН > 6 дистиллированную воду необходимо прокипятить и охладить до температуры 25 - 30 °С. При подготовке стеклянной посуды не допускается использовать синтетические моющие средства. В.1.1 Стандарт-титр переносят в мерную колбу 2-го класса по ГОСТ 1770 (далее - колба). В.1.2 Извлекают флакон (ампулу) из упаковки. В.1.3 Промывают поверхность флакона (ампулы) водой и просушивают фильтровальной бумагой. В.1.4 Вставляют в колбу воронку, вскрывают флакон (ампулу) в соответствии с инструкцией изготовителя, дают содержимому полностью высыпаться в колбу, промывают флакон (ампулу) изнутри водой до полного удаления вещества с поверхностей, промывные воды сливают в колбу. В.1.5 Заполняют колбу водой примерно на две трети объема, взбалтывают до полного растворения содержимого (за исключением насыщенных растворов гидротартрата калия и гидрооксида кальция). В.1.6 Заполняют колбу водой, не долив воды до метки 5 - 10 см 3 . В течение 30 мин термостатируют колбу в водяном термостате при температуре 20 °С (колбы с насыщаемыми растворами гидротартрата калия и гидрооксида кальция заполняют водой полностью и термостатируют не менее 4 ч при температуре 25 °С и 20 °С соответственно, периодически перемешивая суспензию в колбе встряхиванием). В.1.7 Доводят водой объем раствора в колбе до метки, закрывают пробкой и тщательно перемешивают содержимое. В пробах, отбираемых из насыщенных растворов гидротартрата калия и гидрооксида кальция, осадок удаляют фильтрованием или декантацией. В.2 Хранение рабочих эталонов рН В.2.1 Рабочие эталоны рН хранят в плотно закрытой стеклянной или пластмассовой (полиэтиленовой) посуде в затемненном месте при температуре не выше 25 °С. Срок хранения рабочих эталонов - 1 мес с момента приготовления, за исключением насыщенных растворов гидротартрата калия и гидрооксида кальция, которые готовят непосредственно перед измерением рН и которые хранению не подлежат.

Прежде чем электроды будут применяться первый раз, они должны быть откалиброваны. Для этого имеются специальные калибровочные растворы, которые буферированы на определенные значения pH. Буферизация действует таким образом, что попадание незначительного количества воды при погружении электрода не мешает калибровке. Смысл калибровки состоит в том, чтобы погрешность электрода, связанную с изготовлением и использованием отъюстировать на определенные значения. При этом следует рассмотреть две ошибки: отклонение нулевой точки и «крутизна» погрешности.

Обе погрешности приводят к общей измерительной ошибке. Следовательно, должна проводиться калибровка двух точек с тем, чтобы обе ошибки измерения могли быть исправлены.

Погрешность нулевой точки. Расположенный вверху рисунок показывает кривую измерения и эталонную кривую. В этом примере кривая измерения очевидно отклоняется от эталонной кривой при pH 7, т.е. в нейтральной точке мы фиксируем очевидную погрешность нулевой точки, которая должна устраняться. Электроды сначала вводятся в калибровочный раствор с pH 7. При этом важно, чтобы, как минимум, были погружены в раствор стеклянная мембрана и диафрагма. В нашем примере измеряемая величина лежит выше необходимой, следовательно, отклоняется от номинальной. На потенциометре с меняющимся сопротивлением измеряемая величина юстируется на правильное значение. При этом вся кривая измерений параллельно смещается на погрешность нулевой точки так, чтобы она точно проходила через нейтральную точку. Таким образом, измерительный прибор выставляется на нулевую точку и готов к применению.

Для калибровки pH-электродов сначала необходима установка нулевой точки

Погрешность крутизны. После калибровки нулевой точки мы получаем ситуацию, изображенную на рядом расположенном рисунке. Ноль определяется точно, но измеряемая величина все еще имеет значительную ошибку, так как еще не определена точка крутизны. Теперь выбирается калибровочный раствор, значение pH которого отличается от 7. Большей частью используются буферные растворы в области pH от 4 до 9. Электрод погружается во второй буферный раствор и с использованием потенциометра находится отклонение крутизны от номинального (стандартного) значения. И лишь теперь кривая измерений совпадает с необходимой кривой; прибор откалиброван.

Если выставлена нулевая точка, должна быть выставлена вторая относительная величина – крутизна

Влияние температуры. На изменения значений pH оказывает влияние температура воды. При этом не ясно, необходима ли компенсация температуры в наших измерительных приборах. Расположенная рядом таблица показывает зависимость значений pH от температуры, причем прибор откалиброван при температуре 20 °C. Следует отметить, что для интересующих нас температур и значений pH ошибка измерений из-за отклонений в температуре ограничена вторым знаком после запятой. Поэтому такая ошибка измерений для аквариумистов не имеет практического значения и температурная компенсация не требуется. Наряду с отклонениями чисто измерительного характера на основе различного напряжения на электродах, следует иметь в виду температурные отклонения калиброванных растворов, которые приводятся в расположенной рядом таблице.

Мы видим здесь, что эти отклонения относительно малы и составляют не более чем ±2%.

Отклонение измеренных значений pH в зависимости от температуры

Значение pH
	4	5	6	7	8	9
0 °C	3,78	4,85	5,93	7,00	8,07	9,15
5 °C	3,84	4,89	5,95	7,00	8,05	9,11
10 °C	3,89	4,93	5,96	7,00	8,04	9,07
15 °C	3,95	4,97	5,98	7,00	8,02	9,03
20 °C	4,00	5,00	6,00	7,00	8,00	9,00
25 °C	4,05	5,03	6,02	7,00	7,98	8,97
30 °C	4,10	5,07	6,03	7,00	7,97	8,93
35 °C	4,15	5,10	6,05	7,00	7,95	8,90

Зависимость температуры от буферных растворов

Температура °С	Значение pH	Отклонение %	Значение pH	Отклонение %	Значение pH	Отклонение %
5	4,01	0,25	7,07	1,00	9,39	1,84
10	4,00	0,00	7,05	0,71	9,33	1,19
15	4,00	0,00	7,03	0,43	9,27	0,54
20	4,00	0,00	7,00	0,00	9,22	0,00
25	4,01	0,25	7,00	0,00	9,18	-0,43
30	4,01	0,25	6,97	-0,43	9,14	-0,87
35	4,02	0,50	6,96	-0,57	9,10	-1,30

Контроль. Для контроля рекомендуется еще раз погрузить электроды в буферный раствор при pH 7 и проконтролировать, сходятся ли значения. Если значение pH электрода согласуется с измерительным прибором, он может применяться для измерений проб воды. Если есть персональные претензии к точности, калибровка должна повторяться в установленные сроки. В качестве рекомендации можно предложить от одной до двух недель. При калибровке pH электродов должно также обращаться внимание на то, насколько быстро значение pH на приборе приближается к значению pH в буферном растворе.

Потенциометрия – один из электрохимических методов анализа, основанный на определении концентрации электролитов путём измерения потенциала электрода, погружённого в исследуемый раствор.

Потенциал (от лат. potentia – сила) – понятие, харак-теризующее физические силовые поля (электрическое, магнитное, гравитационное) и вообще поля векторных физических величин.

Метод потенциометрического измерения концентра-ции ионов в растворе основан на измерении разности электрических потенциалов двух специальных электро-дов, помещённых в испытуемый раствор, причём один электрод – вспомогательный – в процессе измерения имеет постоянный потенциал.

Потенциал Е отдельного электрода определяют по уравнению Нернста (W.Nernst– немецкий физико-химик, 1869 – 1941) через его стандартный (нормальный) потенциалЕ 0 и активность ионова + , которые принимают участие в электродном процессе

Е = Е 0 + 2,3 lg a + , (4.1)

где E 0 – составляющая межфазной разности потенциалов, которая определяется свойствами электрода и не зависит от концентрации ионов в растворе;R – универсальная газовая постоянная;n – валентность иона;Т – абсолютная температура;F – число Фарадея (M.Faraday– английский физик ХIХ века).

Уравнение Нернста, выведенное для узкого класса электрохимических систем металл – раствор катионов этого же металла, справедливо в значительно более широких пределах.

Потенциометрический метод наиболее широко применяют для определения активности ионов водорода, характеризующей кислотные или щелочные свойства раствора.

Появление водородных ионов в растворе вызвано диссоциацией (от лат. dissociatio - разъединение) части молекул воды, распадающихся на ионы водорода и гидроксила:

H 2 O ↔
+
. (4.2)

По закону действующих масс константа К равновесия реакции диссоциации воды равнаK =
.
/
.

Концентрация недиссоциированных молекул в воде настолько велика (55,5 М), что её можно считать постоянной, поэтому уравнение (5.2) упрощают:
= 55,5 =
.
, где
- константа, называемая ионным произведением воды,
= 1,0∙10 -14 при температуре 22 о С.

При диссоциации молекул воды ионы водорода и гидроксила образуются в равных количествах, следовательно, их концентрации одинаковы (нейтраль-ный раствор). Исходя из равенства концентраций и известной величины ионного произведения воды, имеем

[Н + ] =
=
= 1∙10 -7 . (4.3)

Для более удобного выражения концентрации ионов водорода химик Зеренсен (P.Sarensen– датский физико-химик и биохимик) ввёл понятиеpH(p– начальная буква датского словаPotenz– степень,H– химический символ водорода).

Водородный показатель рН – величина, характери-зующая концентрацию (активность) ионов водорода в растворах. Он численно равен десятичному логарифму концентрации ионов водорода
, взятому с обратным знаком, т.е.

рН = - lg
. (4.4)

Водные растворы могут иметь рН в интервале от 1 до 15. В нейтральных растворах при температуре 22 о С рН = 7, в кислых рН < 7, в щелочных рН > 7.

При изменении температуры контролируемого раствора электродный потенциал стеклянного электрода меняется из-за наличия коэффициента S = 2,3∙в уравнении (4.1). Вследствие этого одной и той же величине рН при разных температурах раствора соответствуют различные значения эдс электродной системы.

Зависимость эдс электродной системы от рН при разных температурах представляет собой пучок прямых (рис. 4.1), пересекающихся в одной точке. Эта точка соответствует величине рН раствора, при которой эдс электродной системы не зависит от температуры, её называют изопотенциальной (от греч.  - равный, одинаковый и …потенциальная ) точкой. Координаты изопотенциальной точки (Е И и рН И) являются важнейшими характеристиками электродной системы. С учётом температуры статическая характеристика (4.1) примет вид

рН-электроды - это не идеальные системы. Они могут иметь различную длину, несовершенную геометрическую форму, нарушения в составе внутреннего электролита и т.д. Все это влияет на их характеристики и, в тоже время, это вполне нормально, так как в любом производстве существуют определенные допуски. Поэтому каждый рН-метр нуждается в калибровке, которая помогает прибору установить соотношение между сигналом от электрода и значением рН в растворе.

Калибровка - очень ответственный момент! Надо отдавать себе отчет о невозможности измерения рН с точностью большей, чем используемые стандарты. Например, если Вы хотите работать с точностью 0.01рН, то необходимо выполнение следующих условий: суммарная погрешность рН-метра и электрода не должна превышать 0.005 рН и проводить калибровку следует с особым вниманием на специальных высокоточных буферных растворах. Купить такие растворы нельзя, поскольку они не хранятся. Их придется готовить самостоятельно, с использованием специально подготовленных реактивов и воды.

Если у Вас нет возможности приготовить буфер с точностью +/- 0.005 рН, то придется довольствоваться фирменными буферными растворами, точность которых обеспечивается на уровне +/- 0.02рН. При калибровке по таким стандартам суммарная погрешность не будет превышать 0.04 – 0.03 рН, при условии, что погрешность прибора находится на уроне 0.01 рН. Это самая распространенная практика, и Вы не найдете ни одной методики или ГОСТа, где требовалась бы поддержание рН с точностью выше, чем 0.05 рН. Исключение составляют лишь некоторые фармацевтические и специализированные производства.

Современные рН-электроды как правило комбинированные, т.е. в одном корпусе находятся и рН-электрод, и электрод сравнения. Помимо удобства в работе, это обеспечивает более быстрый отклик и снижает суммарную ошибку.

Изоэлектрическая точка для таких электродов находится на рН=7 (0 мВ). Поэтому, в первую очередь, прибор следует калибровать по буферу с нейтральным рН (например, 6.86 или 7.01). Вторую точку следует выбирать на расстоянии примерно 3 единицы рН, т.е. рН=4 или 10. Если прибор калибруется только по двум буферам, то выбор второй точки зависит от диапазона, в котором Вы преимущественно работаете. Если это щелочные растворы, то воспользуйтесь буфером с рН=10, если кислые – с рН=4. Это связанно с некоторой разницей в наклонах калибровочных прямых в кислой и щелочной области. Проблем не возникнет, если Ваш прибор может калиброваться по трем и более точкам. В этом случае порядок калибровки не важен, так как рН-метр самостоятельно его отслеживает.

На недорогих моделях рН-метров (HI8314, Piccolo, Checker) для калибровки предусмотрены два винта: один для настройки изоэлектрической (опорной) точки (рН7), другой для настройки наклона (рН4/10). Очень часто при использовании их путают, и возникает ситуация, когда взаимное положение винтов не позволяет провести калибровку. В этом случае, перед проведением калибровки следует выставить оба винта в среднее положение (1/2 оборота для Piccolo и 15-16 оборотов для остальных моделей от крайнего положения).

Наиболее совершенные модели рН-метров имеют т.н. поддержку GLP, которая помимо даты последней калибровки позволяет оценить состояние электрода на основании данных об отношении наклона калибровочной кривой к теоретическому значению (59.16 при 25С) в %. Если у прибора нет поддержки GLP, но имеется режим измерения мВ, то наклон можно рассчитать самостоятельно, измерив значение мВ в буфере рН=7 и рН=4.

Например:

pH7 = -10 мВ
pH4 = +150 мВ
наклон = 150 – (-10)/59.2х3 = 90.1%
95 – 102% - электрод в рабочем состоянии,
92 – 95% - электрод нуждается в очистке,
менее 92% - необходимо сменить электролит или заменить электрод.

Проблема термокомпенсации, автоматическая термокомпенсация

Проблема компенсации изменений температуры одна из самых важных и самых трудно решаемых в рН-метрии. Погрешность в измерения возникает по трем причинам: В уравнение Нернста входит температура; Равновесные концентрации ионов водорода в буфере и образцах меняются в зависимости от температуры; Характеристики рН-электрода зависят от температуры. 1. Согласно уравнению Нернста, теоретический наклон калибровочной кривой изменяется с температурой. Если прибор не учитывает этого изменения, то к погрешности измерений добавляется ошибка в среднем равная 0.003рН на каждый градус Цельсия и каждую единицу рН от изопотенциальной точки.

Например: прибор откалиброван по буферу рН=7 при температуре 25С.
Образец с рН=5 при 20С, ошибка = 0.003 х 5 х 2 = 0.03
Образец с рН=2.5 при 2С, ошибка = 0.003 х 23 х 4.5 = 0.31
Образец с рН=12 при 80С, ошибка = 0.003 х 55 х 5 = 0.82

Компенсировать изменение наклона калибровочной прямой очень просто, поэтому это делает практически любой современный рН-метр, за исключением самых простейших. Это то, что в рекламных проспектах и спецификациях называется "автоматической термокомпенсацией" (автотермокоменсация, АТС, ATC). Но ни один из приборов не позволяет учитывать следующие две составляющие погрешности. 2. Гораздо более сложной задачей является компенсация изменений равновесных концентраций ионов водорода в образцах с изменением температуры. Проблема заключается в том, что не зная точного химического состава образца невозможно предсказать характер этих изменений. Существует только общая закономерность, что рН нейтральных и щелочных растворов сильнее зависит от изменения температуры, чем рН кислых растворов. При изменении температуры на 25-30 градусов рН может измениться на 0.5 – 1 единицы. Обычные общелабораторные рН-метры никак не учитывают этот фактор, да его и невозможно учесть, так как растворы бывают самые разные. Исключения не составляют и буферные растворы:

температура	значение pH

3. Кроме вышеперечисленных причин, температура влияет и на сам корпус электрода и на электролит, находящийся в нем. Все это заметно сказывается на значении рН. Практически никто из производителей этого не учитывает. Исключение составляет Orion, разработавший технологию LogR. Ее суть заключается в том, что сопротивление (R) чувствительной части рН-электрода обратно пропорционально температуре: LogR = 1/T Помимо учета изменяемых с температурой характеристик электрода, это позволяет в принципе отказаться от параллельного измерения температуры, заменив температуру в уравнении Нернста обратным логарифмом сопротивления электрода. К сожалению, из-за низкой точности измерения температуры данная технология не получила широкого распространения.

Что нужно знать о термокомпенсации

1. Под автоматической термокомпенсацией в рН-метрии подразумевается только учет температуры, входящей в уравнение Нернста.

2. Если Вы хотите знать точное значение рН образца при 25С, единственный реальный выход – это измерить его при 25С.